La iglesia de Santa María presenta una planta de tres naves —la central es más ancha y alta— y cuatro tramos, cubiertos con bóvedas de crucería. Se remata en su parte oriental por un ábside poligonal donde se halla el famoso retablo de Fernando Gallego. Aunque sus orígenes son medievales, y su construcción debió de iniciarse poco después de la conquista de la ciudad por las tropas cristianas en 1232, casi todo lo que hoy vemos se debe a la obra del siglo XVI, en la que se aprovechan elementos de los edificios anteriores. Al exterior presenta dos torres, una más antigua y medieval, muy reconstruida, junto a la cabecera, y otra más moderna de los siglos XVI-XVIII a los pies.
Además del Retablo Mayor, cabe destacarse en su interior el coro en alto que se encuentra en la entrada, varias capillas privadas, y algunas sepulturas de las familias más linajudas de Trujillo.
La documentación nos ha permitido conocer el nombre de muchos de los artistas que trabajaron en la construcción de la iglesia, caso de los arquitectos Alonso y Francisco Becerra, Sancho de Cabrera, Pedro de Hermosa, Francisco y Martín Vizcaíno, o de los canteros Pedro y Francisco Bote, etc.
En el ábside de la iglesia de Santa María, y ligeramente elevado por unas gradas, se halla el famoso retablo de Fernando Gallego, realizado en los últimos años del siglo XV. Se organiza en siete calles, divididas a su vez en tres cuerpos, sobre predela.
La calle central, además de ser más ancha que las otras, presenta una disposición diferente al ocupar su centro una imagen la Virgen María realizada por Modesto Pastor en el siglo XIX, lo que motivó que la tabla pictórica que allí existía (Cristo crucificado) se trasladara a la sacristía.
La estructura arquitectónica del conjunto remite a motivos principalmente góticos (tracerías, elementos decorativos vegetales, etc.), salvo su parte superior que se remata con elementos barrocos claramente introducidos con posterioridad a la ejecución del retablo. En su parte inferior fue colocado un sagrario en 1595.
La fama de toda esta obra se debe al conjunto de veinticinco pinturas sobre tabla, realizadas en gran medida por el artistaFernando Gallego, gran exponente de lo que se ha denominado el arte hispano-flamenco. Las escenas escogidas son variadas, y en ellas podemos observar algunos episodios de la vida de Cristo y de la Virgen María, así como la representación de los evangelistas —entre los que destacaríamos a San Mateo y los padres de la Iglesia. Además de la temática, y de la calidad técnica de la pintura, resulta de gran interés la minuciosidad con la que el artista ha elaborado su trabajo, ya que en cada una de las tablas vemos multitud de detalles de la vida cotidiana, de la arquitectura o de las vestimentas del momento
El Retablo Mayor de Santa María de Trujillo constituye un documento visual de gran valor, que nos permite conocer muchos detalles de la sociedad española de finales del siglo XV.
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